Un gen consta de dos elementos funcionales principales: la primera consiste en una secuencia de DNA denominada codificante que codifica la secuencia de la proteína producida. En segundo lugar, una secuencia promotora específica unida a la región codificante que regula la transcripción del gen. El promotor sirve para activar o suprimir la expresión del gen según se requiera.
El objetivo principal de los ensayos de genes indicadores es investigar el promotor de un gen de interés, es decir, la regulación de su expresión. Esto se puede hacer uniendo el promotor de interés a un gen fácilmente detectable, tal como el gen de la luciferasa de luciérnaga, que cataliza una reacción que produce luz.
Habitualmente, las células se exponen entonces a diferentes factores o condiciones, o se pueden realizar cambios en el promotor, y los efectos de esas condiciones se podrán seguir fácilmente midiendo los cambios en la emisión de luz.
Ejemplos de genes reporteros
Genes indicadores comunes son β-galactosidasa, β-glucuronidasa y luciferasa. Se usan diversos métodos de detección (véase más adelante) para medir la proteína expresada del gen indicador. Estos incluyen luminiscencia, absorbancia y fluorescencia.
Los ensayos basados en luminiscencia son muy populares por varias razones:
- tienen una alta sensibilidad (entre 10 y 10.000 veces mayor que los métodos basados en absorbancia o fluorescencia, dependiendo del ensayo específico y el indicador utilizado)
- la mayoría de los tipos de células no tienen actividad luciferasa endógena
- los ensayos de luminiscencia tienen un gran rango dinámico
- son rápidos de realizar
- sus costos son relativamente bajos
Los ensayos indicadores luminiscentes se miden usando un luminómetro.
Genes reporteros por método de detección
Reportero | Luminiscencia | Fluorescencia | Absorbancia |
|---|---|---|---|
Luciferasa | |||
| β-Galactosidase (β-Gal) | |||
| β-Glucuronidase (β-GUS) | |||
Fosfatasa alcalina secretada (SEAP) | |||
Proteína verde fluorescente (GFP) | |||
Luciferasa de luciérnaga
El gen indicador más versátil y común es la luciferasa de la luciérnaga norteamericana Photinus pyralis. La proteína no requiere modificación postraduccional para la actividad enzimática. Ni siquiera es tóxico in vivo en alta concentración y puede usarse tanto en células procariotas como eucariotas. La luciferasa de luciérnaga cataliza la oxidación bioluminiscente de la luciferina en presencia de ATP, magnesio y oxígeno.
Sistema reportero Dual Luciferase®
El sistema de ensayo Dual Luciferase® Reporter (DLR) contiene dos luciferasas reporteras diferentes que se expresan simultáneamente en cada célula. La luciferasa de luciérnaga y la luciferasa de Renilla pueden discriminar entre sus respectivos sustratos de bioluminiscencia y no se activan de forma cruzada. La luciferasa de luciérnaga está controlada por el promotor de interés y la luciferasa de Renilla por un promotor que proporciona una expresión estable; de esta manera, la expresión de la luciferasa de Renilla puede usarse como control interno para compensar cualquier cambio en el número de células, la eficacia de la transfección y otros errores. Si bien esto es muy conveniente, se debe tener precaución para garantizar que ninguna de las condiciones analizadas modifique la expresión de la luciferasa de Renilla, ya que esto podría conducir a conclusiones falsas.
Nuevas luciferasas
En los últimos años se han usado otras luciferasas para ensayos de genes indicadores, tales como luciferasas Gaussia, Cypridina o NanoLuc®. Estas llamadas "nuevas" luciferasas son hasta 1000 veces más brillantes que las luciferasas de luciérnaga o Renilla, y normalmente tienen otras ventajas, por ejemplo, estabilidad mejorada, tamaño más pequeño, secreción extracelular u otras.
Notas de aplicación relacionadas con genes indicadores
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Instrumentos recomendados para ensayos de genes reporteros
Dual-Luciferase y NanoLuc son marcas registradas de Promega Corp.